萤火虫荧光素酶是基因表达研究中最常用的报告基因之一，因为它具有极高的灵敏度和快速、易于使用的系统。它是一种约61 kDa的蛋白质，作为单体具有活性，不需要加工即可发挥其活性。通过催化荧光素的氧化羧化，萤火虫荧光素酶产生的反应是已知生物发光中效率最高的反应之一。

当荧光素添加到荧光素酶样品中时，会立即出现闪光，并在0.3-0.5s内达到峰值强度。然后光开始迅速衰减，半衰期约为0.5-1.0分钟。但是，将辅酶A添加到检测缓冲液中，能够防止快速反应衰减，从而将反应的半衰期从2-5分钟延长。

一、D-荧光素钾盐体外发光检测所需试剂

1.D-荧光素钾盐（GOLDBIO，LUCK-100/LUCK-1G）

2.GoldBio荧光素酶检测缓冲液（TMCA）

3.PBS（不含Ca²⁺、Mg²⁺）

4.细胞裂解缓冲液

5.荧光素酶（用于对照）

二、GoldBio荧光素原液（GLSS）制备

1.配制15 mg/mL（100X）GLSS。

2.荧光素酶发光测定中荧光素底物GLSS的最终浓度应为：150 μg/ml（荧光素-K 为471μM）。

三、GoldBio荧光素酶检测缓冲液（TMCA）制备

1.配制10mL 500mM MgCl₂（100x）溶液。

2.配制10mL 25mM CoA（100x）溶液。

3.配制10mL 15mM ATP（100x）溶液。

4.配制100mL 400mM Tris-HCl，pH 7.8(4x)缓冲液。

6.在室温下制备新鲜的2×TMCA工作原液。

例如配制1 ml TMCA（2x）：

500 µl Tris-HCl（4x原液），

20 µl MgCl₂（100x原液），

20 µl CoA（100x原液），

20 µl ATP（100x原液），

用水稀释至1 ml体积。

四、制备细胞裂解物用于荧光素酶提取（以哺乳动物细胞为例）

1.以200-500 x g的速度离心5分钟，使细胞沉淀。取出并丢弃上清液。

2.用5-10 ml PBS（不含Ca²⁺、Mg²⁺）清洗细胞沉淀一次。去除上清液后，轻轻敲击离心管壁使细胞松散。轻轻上下吹打，将细胞重新悬浮在5-10 ml PBS 中。再次通过离心使细胞沉淀。

3.弃掉PBS清洗液。

4.通过轻轻上下吹打将沉淀物重新悬浮在剩余体积的PBS清洗液中。添加哺乳动物细胞裂解缓冲液并悬浮细胞沉淀物（每10 ml完全生长的悬浮培养物，添加约1 ml哺乳动物细胞裂解缓冲液）。

5.使用移液器悬浮细胞，直到获得均匀的悬浮液。将悬浮液在冰上孵育15-30分钟。期间定时倒置悬浮液以帮助细胞裂解。

6.将悬浮液在冷冻离心机中以20,000 x g的速度离心30分钟。收集澄清的悬浮液进行分析。

五、D-荧光素钾盐体外发光检测

在检测反应混合物中，TMCA的最终浓度应分别为1×。裂解物和GLSS的体积应相应调整。

示例：使用手动光度计检测（200 μl 最终反应体积）

1.将100 μL TMCA移液到干净的光度计比色皿中。

2.将50-98 μL裂解物移液到比色皿中。

3.用H₂O补足，使总体积达到198 μl。

4.移液2 μl GLSS（1x最终浓度）并立即在光度计上读数。

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