TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 细胞凋亡检测是一种常用的方法来检测DNA的断裂，通常用于检测细胞凋亡。这种方法通过标记DNA断裂末端来识别凋亡细胞。TUNEL检测在生物医学研究中非常重要，尤其是在研究癌症、神经疾病和其他与细胞凋亡相关的疾病时。

一、TUNEL细胞凋亡检测原理

细胞在发生凋亡时，会激活一些特异性的DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。使得凋亡细胞的DNA被切割成180~200bp片段，在琼脂糖凝胶上通常以180~200bp的阶梯状迁移。TdT酶（脱氧核糖核酸末端转移酶）将标记的dUTP连接到断裂DNA暴露的3'-OH末端，通过在这些末端添加荧光 dUTP的方式来标记晚期凋亡细胞，从而可以通过荧光显微镜进行检测。

二、TUNEL细胞凋亡检测方法（以细胞涂片为例）

（1）收集细胞，加入一定体积的PBS重悬细胞沉淀，然后加入和PBS等体积的固定液，室温固定15~20 min或4°C固定1~2 h。600×g离心5 min，PBS重悬，取25~50 μL细胞悬液涂片在载玻片上晾干。

（2）固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

（3）将样本浸入通透液中，37°C 10 min。

（4）将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

（5）阳性对照组和阴性对照组分别加入100 μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的样本上，室温平衡5 min，再加入DNase I Buffer 孵育阴性样本，37°C孵育10~30 min后，将样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

（6）实验组通透完成后在PBS中静置，等待阳性对照和阴性对照处理后共同进行标记染色。根据样本量配制标记工作液，每个样本用量按照试剂盒要求配制，充分混匀，现用现配。

（7）每个样本滴加100 μL TdT平衡缓冲液，置于37°C湿盒中平衡10~30 min。

（8）吸水纸吸除TdT 平衡缓冲液（注意不要干片）。每个样本滴加50 μL标记工作液，放入湿盒中37°C避光反应60 min。

注：如果信号强度较弱，则可延长DNA标记反应的培养时间。

（9）样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

（10）吸水纸吸干水分后滴加DAPI工作液，室温避光孵育5min，对细胞核进行复染。

（11）样本浸入PBS漂洗4次，每次5 min。

（12）用吸水纸吸干多余的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片。

（13）在荧光显微镜下选择合适的滤光片观察结果。

三、TUNEL细胞凋亡检测注意事项

1.洗涤过程应充分洗涤，否则会影响后续实验中酶的活性（如DNase I和TdT酶）。

2.用PBS清洗样本后，请用吸水纸吸干样本周围的液体。

3.实验过程中请保持样本的湿润，注意不要干片。

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