聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）是生物化学与分子生物学领域中用于蛋白质及寡核苷酸分离的核心实验技术。相较于琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶具有更小的孔径和更高的分辨能力，能够实现对分子量差异极小的蛋白质分子的精细分离。本文将从基本原理、技术分类、实验流程及注意事项等方面，系统介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准化操作方法，为科研工作者提供可靠的技术参考。

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide）与交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）在催化剂作用下聚合形成的三维网状结构高分子基质。该凝胶基质的孔径大小可通过调整丙烯酰胺浓度精确控制，浓度越高，孔径越小，对小分子量蛋白质的分辨能力越强。

蛋白质分子在凝胶中的迁移行为受多重因素共同影响：蛋白质表面所带净电荷决定了其在电场中的迁移方向与驱动力大小；蛋白质的分子量与空间构象则决定了其在凝胶网络中所受的摩擦阻力。在恒定电场条件下，电荷密度高、分子量小、构象紧凑的蛋白质分子迁移速率较快，反之则较慢，由此实现不同蛋白质组分的有效分离。

二、SDS-PAGE与Native-PAGE的技术差异

根据实验目的不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为两种主要类型：

SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳） ：在样品处理过程中加入十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（如β-巯基乙醇或DTT），使蛋白质充分变性、解聚并呈线性伸展构象。SDS以固定比例与蛋白质结合，屏蔽其天然电荷差异，使所有蛋白质-SDS复合物携带近似相同的单位质量电荷。在此条件下，蛋白质的迁移速率仅取决于分子量大小，SDS-PAGE因此成为蛋白质分子量测定和纯度鉴定的标准方法。

Native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳） ：电泳过程中不加入SDS和还原剂，蛋白质保持其天然构象与生物活性。Native-PAGE的分离结果同时受蛋白质电荷、分子量及空间形状的影响，适用于研究蛋白质的天然状态、寡聚体组成、酶活性分析及蛋白质-蛋白质相互作用等。

三、标准化实验流程（以Native-PAGE为例）

1.器材准备

将玻璃板、 spacer及梳子依次用双蒸水彻底清洗，以75%酒精棉球擦拭表面，晾干后组装电泳装置，确保密封良好、无漏液。

2.凝胶配制

根据目标蛋白分子量选择适当分离胶浓度。

3.灌胶与聚合

将配制好的分离胶溶液迅速注入两块玻璃板夹层中，控制液面高度使点样孔前端与分离胶顶部保留约2.5 cm距离。沿玻璃板侧壁缓缓覆盖约0.5 cm厚的双蒸水封层，以隔绝空气、确保凝胶表面平整。待分离胶完全聚合（约30~45分钟）后，倾去上层水层，用双蒸水冲洗凝胶顶面，并用吸水纸吸除残留液体。随后灌入浓缩胶，插入梳子，待其完全聚合。

4.上样与电泳

拔出梳子，用双蒸水冲洗加样孔。加入电泳缓冲液，使用微量移液器将样品缓慢注入加样孔底部。初始阶段施加200 V恒压电泳，待溴酚蓝指示带进入分离胶后将电压调至250 V，继续电泳直至指示剂迁移至凝胶底部。

5.染色与成像

电泳结束后取出凝胶板，浸入0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30分钟。倒去染色液，加入脱色液于摇床上缓慢振荡脱色，期间多次更换脱色液，直至凝胶背景清晰、蛋白条带对比分明。使用凝胶成像系统拍照记录并分析蛋白条带。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质研究中不可或缺的基础分离技术。实验人员应根据目标蛋白特性合理选择SDS-PAGE或Native-PAGE体系，严格控制凝胶配制比例、聚合条件及电泳参数，以获得高分辨率、可重复的实验结果。